1 引 言 
　　甾醇是一類具有生物活性的物質(zhì)，廣泛存在于自然界中，與動(dòng)植物的新陳代謝密切相關(guān)[1，2]。大氣顆粒物中的甾醇類化合物主要包括膽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇及β谷甾醇等。有關(guān)研究表明：膽甾醇可以作為城市大氣中烤肉等烹飪?cè)吹氖聚櫥衔?，?beta;谷甾醇可作為生物質(zhì)燃燒的有機(jī)示蹤化合物[3，4]，因此大氣顆粒物中甾醇類化合物的分析測(cè)定對(duì)顆粒物源解析工作非常重要。 
　　甾醇的分析方法很多，主要有化學(xué)分析法、薄層色譜法、氣相色譜分析法及液相色譜分析法等?；瘜W(xué)分析法（包括毛地黃皂甙法及酶法）只能測(cè)定甾醇的總量，薄層色譜法靈敏度和重現(xiàn)性較差，氣相色譜直接進(jìn)樣法進(jìn)樣口溫度過(guò)高，易造成目標(biāo)化合物的分解，液相色譜與紫外（Ultraviolet，UV）及蒸發(fā)光散射檢測(cè)器聯(lián)用法選擇性差，靈敏度較低[5，6]。 
　　氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析方法（Gas chromatographymass spectrometry， GC/MS）是常用的甾醇類化合物標(biāo)準(zhǔn)分析方法[7，8]，該方法使用衍生化試劑與樣品進(jìn)行衍生反應(yīng)，應(yīng)用質(zhì)譜檢測(cè)器（MS）進(jìn)行測(cè)定。方法流程長(zhǎng)，試劑毒性大，檢測(cè)成本高，分析時(shí)間長(zhǎng)。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法無(wú)需衍生，檢測(cè)快速、，是進(jìn)行甾醇類物質(zhì)含量測(cè)定的有效方法，食品、動(dòng)物體中甾醇類化合物的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)工作已經(jīng)開展[9，10]，但使用該方法進(jìn)行大氣顆粒物中甾醇類化合物的分析尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。在前人工作基礎(chǔ)上，本研究采用聲萃取與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，建立了測(cè)定大氣顆粒物中4種甾醇類化合物的方法。測(cè)量精密度小于20%。相比氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析甾醇類化合物的方法，本方法更加快速、經(jīng)濟(jì)，靈敏，為大氣顆粒物中甾醇類化合物的分析提供了較好的。 
　　2 實(shí)驗(yàn)部分 
　　2.1 儀器與試劑 
　　Waters Alliance 2695液相色譜儀、Quattro Premier XE 三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）；TDZ5WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)（湘儀離心機(jī)廠）；氮?dú)庹舭l(fā)儀（NEVAPTM111，美國(guó) Organomation Associates公司） 
　　甲醇、二氯甲烷、正己烷和乙腈（色譜純，美國(guó)J T Baker公司），娃哈哈純凈水（市售），植物甾醇標(biāo)準(zhǔn)品膽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β谷甾醇（百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司）。
　　2.2 樣品來(lái)源 
　　2012年及2013年在北京市部分地區(qū)使用大流量采樣器采集大氣顆粒物樣品，濾膜為玻璃纖維及石英材質(zhì)，采樣流速1.13 m3 /min，采樣時(shí)間24 h，濾膜面積50.24 cm2。為了去除干擾，濾膜在采樣前，在馬弗爐中550℃加熱6 h以上，濾膜經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定不含有目標(biāo)化合物。 
　　2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 
　　取膽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇及β谷甾醇固體，配成濃度為1000 μg/mL的甲醇儲(chǔ)備液，再逐級(jí)稀釋成0.01，0.05，0.1， 0.2， 0.5， 1.0， 2.0， 5.0和10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。 
　　2.4 樣品前處理 
　　截取6.1544 cm2帶有顆粒物樣品的濾膜加入5 mL甲醇聲萃取兩次，離心分離后，在氮?dú)猸h(huán)境中濃縮至1 mL， 經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)行儀器分析。 
　　2.5 色譜及質(zhì)譜條件 
　　Atlantis C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 μm，Waters公司），流動(dòng)相：乙腈（A）和水（B），梯度洗脫程序?yàn)椋?～10 min，90%B；10～11 min，90%～100%B；11～12 min，100%～90%B。柱溫40℃，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣體積：50.0 μL。使用大氣壓化學(xué)離子源（Atmospheric pressure chemical ionization，APCI），正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple reaction monitoring，MRM）模式；電暈電流：2.0 μA；離子源溫度：120℃；脫溶劑溫度：500℃；脫溶劑氣流量：600 L/h；錐孔氣流量：50 L/h。在樣品測(cè)試前，使用調(diào)諧液校正質(zhì)量軸。 
　　2.6 樣品測(cè)定 
　　用針泵直接進(jìn)樣，確定了4種甾醇的質(zhì)譜分析參數(shù)，列于表1。 
　　3 結(jié)果與討論 
　　3.1 萃取條件的選擇 
　　3.1.1 萃取溶劑的選擇 考察甲醇、正己烷、二氯甲烷、正己烷二氯甲烷（1∶2， V/V）及甲醇與二氯甲烷不同比例混合溶劑（3∶2， 2∶1， 4∶1， V/V）對(duì)顆粒物樣品的萃取效果，結(jié)果見圖1。甲醇、二氯甲烷、正己烷等溶劑均可萃取顆粒物樣品中甾醇，但甲醇對(duì)4種甾醇萃取效率較高，另外，甲醇與流動(dòng)相互溶性很好，故選取甲醇做萃取溶劑。 
　　3.1.2 萃取溶劑體積的選擇 
　　用特制裁刀截取6.1544 cm2的帶顆粒物樣品的濾膜，比較加入萃取溶液體積為5 mL， 6 mL， 8 mL， 10 mL及12 mL的萃取情況。結(jié)果表明， 隨著萃取溶劑量的增加，目標(biāo)化合物萃取量有所增加，但體積加大，目標(biāo)化合物濃度會(huì)降低，濃度過(guò)低必須經(jīng)過(guò)濃縮才能測(cè)定，且溶液體積增加濃縮損失加大。綜合各種因素，發(fā)現(xiàn)5 mL溶劑可以較*地萃取顆粒物中的4種甾醇類化合物，同時(shí)樣品經(jīng)濃縮后的濃度在定量分析范圍之內(nèi)，因此選取萃取溶劑體積5 mL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.1.3 聲萃取次數(shù)及時(shí)間 實(shí)驗(yàn)考察了聲10， 20及30 min的萃取效果，比較了1次和2次、3次聲的效率，發(fā)現(xiàn)隨著聲時(shí)間的延長(zhǎng)及次數(shù)的增加，萃取量增大。但聲時(shí)間從20 min延長(zhǎng)至30 min時(shí)，萃取量增加很少，而花費(fèi)時(shí)間較多。聲3次比2次萃取量大一些，但轉(zhuǎn)移、濃縮的損失也增加，因此選擇聲2次、每次20 min萃?。ㄒ妶D2及圖3），回收率實(shí)驗(yàn)表明這種萃取可以滿足顆粒物中甾醇類化合物的分析要求（表3）。 
　　3.2 色譜條件的選擇 
　　3.2.1 色譜柱的選取 
　　甾醇類化合物分子極性較弱，可以選取反相色譜柱進(jìn)行分離。本研究比較了6種C18柱（Symmetry C18 ， Agilent Eclipse XDBC18， XTerra C18， Xbridge C18， Atlantis C18和Hypersil ODS柱）及1種C8柱（XTerra C8）對(duì)4種植物甾醇的分離情況。結(jié)果表明， 大多數(shù)色譜柱可以分離膽甾醇及β谷甾醇，不能分開菜油甾醇及豆甾醇。有文獻(xiàn)報(bào)道在使用乙腈/異丙醇做流動(dòng)相時(shí)，Waters Symmetry C18色譜柱近1 h可分開上述兩種化合物，但考慮異丙醇粘度較大，不適于做質(zhì)譜分析[11]。本實(shí)驗(yàn)采用Atlantis C18色譜柱， 在乙腈、水做流動(dòng)相時(shí)， 對(duì)4種甾醇類化合物實(shí)現(xiàn)了較好的分離，尤其是菜油甾醇及豆甾醇的分離度較大，同時(shí)靈敏度也較高，優(yōu)于前期報(bào)道[9，11～15]。 
　　3.2.3 色譜柱柱溫對(duì)分離的影響 
　　柱溫是影響分離度及柱效的主要原因之一，溫度升高，溶質(zhì)和溶劑分子擴(kuò)散加快，且流動(dòng)相的傳質(zhì)阻力減小，化合物容量因子變小?？疾炝酥鶞?5℃， 30℃， 35℃， 40℃， 45℃及50℃時(shí)4種甾醇的分離情況。4種甾醇化合物的容量因子隨柱溫變化如圖5所示。柱溫過(guò)高會(huì)損壞色譜柱填料，縮短柱子使用壽命。在同等分離效果下，綜合對(duì)色譜柱性能的保護(hù)和柱效的考慮，選擇40℃作為4種甾醇的分析的色譜條件。在此溫度下，甾醇化合物分離較好，靈敏度較高，且分析時(shí)間適當(dāng)（15 min內(nèi)完成分析）。 
　　3.2.4 流速的選取 
　　流速的選擇綜合了目標(biāo)化合物的分離、檢測(cè)靈敏度及色譜峰的保留時(shí)間來(lái)確定。本研究進(jìn)行了幾種流速（0.3， 0.5， 0.7和0.8 mL/min）的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在較低的流速（如0.3 mL/min）下4種甾醇的保留時(shí)間較長(zhǎng)，靈敏度較差。隨著流速的提高，保留時(shí)間逐漸縮短，檢測(cè)靈敏度提高。至流速達(dá)到0.8 mL/min時(shí)，難分離物質(zhì)對(duì)分離度適當(dāng)，靈敏度較好，保留時(shí)間也比較合適。綜合考慮各種因素，選擇0.8 mL/min的流速。 
　　3.2.5 進(jìn)樣量的選取 
　　分別選取5， 10， 15， 20， 30和50 μL樣品進(jìn)行分析，結(jié)果表明，色譜峰響應(yīng)值會(huì)隨著進(jìn)樣量增加而增加，為有較高的分析靈敏度，終選取進(jìn)樣量50 μL。 
　　3.3 質(zhì)譜條件的選擇 
　　3.3.1 離子源及電離模式的選取 
　　3.3.2 電暈電流強(qiáng)度的優(yōu)化 質(zhì)譜的電暈電流強(qiáng)度與檢測(cè)靈敏度有一定關(guān)系，本研究進(jìn)行了6種電流強(qiáng)度（1， 2， 3， 4， 5及6 μA）的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)電暈電流為2.0 μA時(shí)， 4種甾醇的信號(hào)強(qiáng)度高，3.0 μA時(shí)次之，其余的條件較低（圖6），故選用2.0 μA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 
　　3.3.3 脫溶劑氣溫度的優(yōu)化 本研究考察了脫溶劑氣溫度400℃，500℃，600℃，800℃的分析效果，發(fā)現(xiàn)不同溫度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近，其中以500℃為，終選取500℃為脫溶劑氣溫度。 
　　3.3.4 脫溶劑氣流速的優(yōu)化 
　　質(zhì)譜的脫溶劑氣流速對(duì)分析靈敏度有一定影響，本研究進(jìn)行了6種氣流流速（400， 500，600，700，800及1000 mL/min）的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)脫溶劑氣流速600 mL/min時(shí)信噪比高，測(cè)定靈敏度，故選用該條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（圖7）。 
　　3.4 方法確證 
　　3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限 取2.3節(jié)配制的甾醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以目標(biāo)組分的響應(yīng)值y對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度x（μg/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以10倍信噪比計(jì)算方法的定量限（LOQ），以3倍信噪比計(jì)算方法檢測(cè)限（LOD）列于表2。在給定的濃度范圍內(nèi)，4種甾醇的線性關(guān)系良好，檢出限與衍生氣相色譜法相當(dāng)[4]，可以滿足大氣顆粒物中甾醇類化合物的分析要求。 
　　3.4.2 方法的度 
　　向大氣顆粒物樣品中添加3個(gè)濃度水平的4種甾醇類化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成低、中及高濃度的加標(biāo)樣品，按照上述方法進(jìn)行前處理，每個(gè)濃度水平平行操作6次，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果列于表3。大氣顆粒物中4種甾醇類化合物的3個(gè)濃度水平加標(biāo)回收率均大于80%，6個(gè)平行樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%，方法度符合有機(jī)分析要求。 
　　3.4.3 方法的精密度 對(duì)兩種不同含量的大氣顆粒物樣品日內(nèi)連續(xù)測(cè)定6次，并進(jìn)行3日內(nèi)的重復(fù)測(cè)定，結(jié)果見表4。4種甾醇類化合物的日內(nèi)重復(fù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，3天的重復(fù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)偏差小于20%，方法日內(nèi)及日間測(cè)定精密度較好。 
　　3.5 實(shí)際樣品的測(cè)定 
　　使用上述方法，對(duì)北京城區(qū)采集的大氣顆粒物樣品進(jìn)行分析，結(jié)果見表5，分析譜圖如圖8。由表5可知，北京城區(qū)的大氣顆粒物樣品中可以檢測(cè)到4種甾醇類化合物，本方法滿足科學(xué)研究及監(jiān)測(cè)管理需求。 
　　4 結(jié) 論 
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)大氣顆粒物樣品前處理方法進(jìn)行篩選，建立了大氣顆粒物中4種甾醇類化合物的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。本方法不需衍生反應(yīng)，操作簡(jiǎn)單，分析快速，4種甾醇類化合物的加標(biāo)回收率大于80%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%，方法檢測(cè)限能夠滿足大氣顆粒物中甾醇類物質(zhì)檢測(cè)分析的要求，適于樣品的分析監(jiān)測(cè)。使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析大氣顆粒物中的甾醇類化合物，拓展了環(huán)境中該類物質(zhì)分析的新思路，對(duì)后續(xù)的監(jiān)測(cè)管理工作提供了。